Grazie per aver visitato nature.com.Stai utilizzando una versione del browser con supporto limitato per i CSS.Per ottenere la migliore esperienza, ti consigliamo di utilizzare un browser più aggiornato (o disattivare la modalità di compatibilità in Internet Explorer).Nel frattempo, per garantire un supporto continuo, stiamo visualizzando il sito senza stili e JavaScript.Nature Communications volume 14, Articolo numero: 798 (2023 ) Cita questo articoloIl virus respiratorio sinciziale (RSV), il metapneumovirus umano (HMPV) e il virus della parainfluenza umana di tipo uno (HPIV1) e tre (HPIV3) possono causare malattie gravi e morte nei pazienti immunocompromessi, negli anziani e in quelli con malattie polmonari sottostanti.Esiste un anticorpo monoclonale protettivo per RSV, ma l'uso clinico è limitato alle popolazioni infantili ad alto rischio.Pertanto, le opzioni terapeutiche per questi virus nelle popolazioni di pazienti vulnerabili sono attualmente limitate.Qui presentiamo la scoperta, la caratterizzazione in vitro e il test di efficacia in vivo di due anticorpi monoclonali cross-neutralizzanti, uno mirato sia all'HPIV3 che all'HPIV1 e l'altro mirato sia all'RSV che all'HMPV.L'anticorpo 3 × 1 è in grado di colpire più virus parainfluenzali;l'anticorpo MxR condivide le caratteristiche con altri anticorpi monoclonali precedentemente riportati che sono in grado di neutralizzare sia RSV che HMPV.Abbiamo ottenuto strutture utilizzando la microscopia crioelettronica di questi anticorpi in complesso con i loro antigeni a una risoluzione di 3, 62 Å per 3 × 1 legato a HPIV3 ea 2, 24 Å per MxR legato a RSV, fornendo una base strutturale per il legame e la neutralizzazione in vitro.Insieme, un cocktail di 3 × 1 e MxR potrebbe avere utilità clinica nel fornire un'ampia protezione contro quattro dei virus respiratori che causano morbilità e mortalità significative negli individui a rischio.I virus respiratori sono una delle principali cause di morte in tutto il mondo, con una stima di 2,7 milioni di decessi attribuibili nel 20151. Mentre un vaccino per prevenire l'infezione da RSV potrebbe essere all'orizzonte2,3, i vaccini protettivi per HMPV, HPIV3 e HPIV1 non sono ancora clinicamente disponibili.Anche se esistessero vaccini protettivi per questi quattro virus respiratori, la vaccinazione di individui altamente immunocompromessi raramente raggiunge l'immunità protettiva.Inoltre, la vaccinazione prima delle terapie immunoablative è spesso inefficace o diminuisce rapidamente, non riuscendo a mantenere una protezione duratura4,5,6.Insieme, RSV, HMPV, HPIV1 e HPIV3 rappresentano una seria minaccia per i pazienti immunocompromessi e, prima della pandemia di COVID-19, erano responsabili della maggior parte delle infezioni virali delle vie respiratorie inferiori nei riceventi di trapianto di cellule staminali ematopoietiche7,8.Negli adulti con altri fattori di rischio, anche il peso della malattia da HMPV e dai virus della parainfluenza è paragonabile a RSV9,10.Inoltre, con l'eccezione dei rinovirus, RSV, HMPV e virus parainfluenzali rappresentano collettivamente anche la maggior parte dei virus respiratori identificati negli adulti ospedalizzati prima del 202011,12.Sebbene le strategie di mitigazione durante la pandemia COVID-19 come il mascheramento, il distanziamento sociale e le chiusure abbiano portato a una diminuzione dei casi di altri virus respiratori durante le stagioni fredde e influenzali 2020-2021, i casi di RSV, HMPV e HPIV stanno iniziando a diminuire aumentare di nuovo e si prevede che nei prossimi anni torneranno ai livelli di circolazione pre-pandemia9,10.Infatti, i modelli prevedono grandi focolai futuri di virus respiratori non SARS-CoV-2 a causa di un aumento delle dimensioni della popolazione suscettibile dopo un periodo di ridotta diffusione13.Inoltre, poiché i virus respiratori endemici tendono a circolare stagionalmente, possono verificarsi coinfezioni con più di un virus respiratorio e sono state associate a esiti peggiori nelle popolazioni vulnerabili14,15,16.La somministrazione di anticorpi monoclonali neutralizzanti (mAbs) fornisce un'efficace alternativa alla vaccinazione per proteggere dalle infezioni virali.Sebbene il palivizumab mAb anti-RSV abbia ricevuto l'approvazione della FDA nel 1998 come profilassi nei neonati ad alto rischio17, rimane relativamente inutilizzato nei bambini immunocompromessi più grandi o negli adulti.Dall'approvazione del palivizumab, mAb ancora più potenti contro l'RSV sono progrediti attraverso studi clinici, con l'obiettivo primario di sostituire il palivizumab come standard di cura per la profilassi nei neonati ad alto rischio.Questa attenzione è stata guidata in parte dal fatto che l'RSV causa fino all'80% delle bronchioliti nei neonati18,19.Tuttavia, negli adulti immunocompromessi, il panorama dei virus respiratori è molto più eterogeneo7,8.Pertanto, una strategia efficace per ridurre il carico complessivo dell'ampia gamma di infezioni del tratto respiratorio inferiore negli adulti a rischio e nei pazienti immunocompromessi deve fare affidamento sul targeting simultaneo di più virus, piuttosto che su un singolo virus.Nonostante i progressi nella ricerca sulla prevenzione dell'RSV, il ruolo dell'immunizzazione passiva per altri virus respiratori rimane poco definito e non sono attualmente disponibili in clinica anticorpi monoclonali in grado di prevenire l'infezione da HMPV, HPIV1 o HPIV3.Per ottenere in modo efficiente una protezione più ampia contro questi virus, abbiamo cercato di identificare mAb neutralizzanti in modo incrociato che potrebbero colpire più di un virus alla volta.RSV, HMPV, HPIV3 e HPIV1 producono tutte proteine ​​di fusione di classe I (F) che sono glicoproteine ​​di superficie essenziali specializzate per mediare la fusione tra le membrane virali e delle cellule ospiti durante l'ingresso virale.HPIV1 e HPIV3 appartengono allo stesso genere Respirovirus e le loro sequenze F condividono il 65% di omologia di sequenza aminoacidica.RSV e HMPV appartengono alla stessa famiglia Pneumoviridae e le loro sequenze F condividono circa il 54% di omologia.Le proteine ​​​​F passano da una conformazione di prefusione metastabile (preF) a una conformazione di postfusione stabile (postF)20,21.Poiché preF è la principale conformazione dei virioni infettivi, gli anticorpi contro preF tendono ad essere i più potenti nel neutralizzare il virus22,23,24,25.Analogamente a RSV, le proteine ​​F HPIV3 e HPIV1 nella conformazione prefusione suscitano titoli anticorpali neutralizzanti più elevati rispetto alla conformazione postfusione26.In uno studio precedente, abbiamo utilizzato la proteina preF HPIV3 stabilizzata per identificare e caratterizzare diversi anticorpi neutralizzanti contro HPIV327.Per l'HMPV, anche se gli anticorpi che prendono di mira la conformazione post-fusione contribuiscono anche alla neutralizzazione dei titoli anticorpali28, l'HMPV postfusione F non suscita anticorpi di neutralizzazione incrociata contro RSV29.Nel presente studio, abbiamo sfruttato l'omologia tra le proteine ​​​​F correlate e ci siamo concentrati sulle loro conformazioni preF per identificare e clonare due potenti mAbs cross-neutralizzanti, 3 × 1 e MxR, dalle cellule B della memoria umana.3 × 1 neutralizza sia l'HPIV3 che l'HPIV1, mentre MxR neutralizza efficacemente sia l'HMPV che l'RSV.Insieme, 3 × 1 e MxR costituiscono un cocktail di anticorpi con la capacità di ottenere una protezione simultanea contro più virus che potrebbe essere utile per le popolazioni a rischio che si trovano in un significativo svantaggio immunologico se infettate da virus respiratori.Poiché praticamente tutti gli esseri umani sono stati esposti a RSV, HMPV, HPIV3 e HPIV130, non è stato necessario preselezionare i donatori per la sieropositività.Poiché vi è una mancanza di mAbs attualmente in fase di sviluppo contro i virus della parainfluenza, abbiamo innanzitutto concentrato i nostri sforzi sullo screening per le cellule B neutralizzanti HPIV3/HPIV1.Poiché non siamo stati in grado di produrre la proteina F HPIV1 nella conformazione preF, per condurre questo schermo abbiamo utilizzato la sola proteina F di HPIV3 sfruttando una strategia esca e interruttore (Fig. 1a, b).Qui, le cellule B leganti HPIV3 sono state isolate incubando 200 milioni di splenociti umani con tetrameri di HPIV3 preF coniugati con allophycocyanin (APC) e tetrameri di HPIV3 postF coniugati con APC/Dylight755 seguiti da arricchimento magnetico con microsfere anti-APC.Novecento cellule B che legavano i tetrameri preF HPIV3 ma non i tetrameri postF sono state ordinate individualmente in pozzetti contenenti cellule feeder 3T3 produttrici di CD40L/IL2/IL21 e quindi incubate per 13 giorni per stimolare la secrezione di anticorpi nei surnatanti di coltura.Per identificare i pozzetti contenenti cellule B candidate che esprimono anticorpi neutralizzanti incrociati, i supernatanti di coltura delle cellule B leganti HPIV3 selezionate individualmente sono stati miscelati con virus HPIV1 vivo e sottoposti a screening per la loro capacità di ridurre la formazione di placca (Fig. 1a, c).Due delle 900 cellule B leganti l'HPIV3 hanno prodotto anticorpi in grado di neutralizzare l'HPIV1 (Fig. 1c).Da queste cellule, i geni espressi della catena pesante (VH3-23) e leggera (Vλ3-19) sono stati sequenziati e clonati con successo per produrre un mAb con capacità di neutralizzazione incrociata contro HPIV3/HPIV1 che abbiamo chiamato 3 × 1 (Fig. 1b, C).3 × 1 è stato isolato da una cellula B che esprime l'isotipo IgA.Poiché il palivizumab e la maggior parte degli altri mAb sviluppati contro i virus respiratori utilizzano una regione costante IgG1, anche 3 × 1 è stato clonato e prodotto per ulteriori studi come IgG1.un approccio Bait-and-switch che utilizza un singolo antigene per identificare le cellule B che neutralizzano in modo incrociato un altro virus correlato.Le cellule B che legano HPIV3 dalla milza umana sono state etichettate con tetrameri coniugati con APC di HPIV3 preF.b Grafico di citometria a flusso delle cellule B preF-leganti HPIV3 dopo il gating per live, CD3−CD14−CD16−CD19+CD20+ (cellule B), IgD−/IgM− (a commutazione di isotipo) e APC/Dylight755− HPIV3 postF− ( per escludere le cellule che si legano a HPIV3 postF, APC o streptavidina).La frazione legata contiene cellule arricchite magneticamente utilizzando microsfere specifiche per APC.I numeri sui grafici sono percentuali delle celle totali nel gate.La casella rossa indica la cellula B da cui è stato derivato 3 × 1 mAb.c Distribuzione della frequenza delle placche HPIV1 per pozzetto dalla schermata di neutralizzazione.La linea tratteggiata indica il numero medio di placche nei pozzetti di controllo negativo contenenti il ​​virus in assenza di anticorpi.La barra rossa include i dati del pozzetto che conteneva la cellula B che produce 3 × 1.d La cinetica di legame di 3 × 1 IgG (in alto) e Fab (in basso) a HPIV3 preF è stata misurata mediante interferometria a biostrato (BLI) per determinare le affinità apparenti (KD).L'associazione con la sonda pre-caricata da 3 × 1 a HPIV3 è stata misurata per 300 s seguita dalla dissociazione per 1200 s.Le misurazioni sono normalizzate contro un anticorpo di controllo dell'isotipo.e Le cellule Vero sono state infettate con HPIV3 o HPIV1 in presenza di diluizioni seriali di palivizumab o 3 × 1. La linea mediana tratteggiata indica PRNT60.I punti dati sono la media ± DS di tre esperimenti indipendenti.Pannello (a) creato con BioRender.com.Sebbene non avessimo la proteina F di HPIV1 stabilizzata nella conformazione preF, abbiamo stimato l'apparente affinità di legame tra 3 × 1 e la proteina F di HPIV3 nella conformazione preF.Come IgG, 3 × 1 si lega strettamente alla proteina preF di HPIV3 (KD <10-12 M) (Fig. 1d).L'affinità di legame di 3 × 1 Fab era inferiore (KD = 1, 9 × 10-7 M), a causa della rapida dissociazione, indicando che è probabile che sia necessario il legame simultaneo di entrambi i Fab per mantenere il legame (Fig. 1d).La potenza neutralizzante di 3 × 1 è stata determinata da un test di neutralizzazione della riduzione della placca del 60% (PRNT60) utilizzando virus vivi per infettare le cellule Vero.3 × 1 aveva una potenza di neutralizzazione altrettanto elevata sia contro HPIV1 che contro HPIV3, con un PRNT60 rispettivamente di 352 e 242 ng/mL (Fig. 1e).Ulteriori indagini hanno rivelato che 3 × 1 ha bloccato la diffusione da cellula a cellula e la formazione di sincizi da parte di HPIV3 nella coltura cellulare (Fig. S1).Questi risultati suggeriscono che l'epitopo di 3 × 1 potrebbe essere funzionalmente conservato tra HPIV3 e HPIV1.Poiché il panorama antigenico di HPIV3 preF non è ben caratterizzato, abbiamo prima eseguito esperimenti di legame incrociato per valutare i siti antigenici su HPIV3 preF consentendo la neutralizzazione.L'epitopo per il mAb 3 × 1 a neutralizzazione incrociata non sembrava sovrapporsi agli epitopi di mAb che avevamo precedentemente isolato che si legano all'apice di preF e HPIV3 neutralizzato (Fig. 2a) 27.Tuttavia, l'epitopo di 3 × 1 sembrava sovrapporsi all'epitopo di un anticorpo PI3-A12 precedentemente descritto, che si lega a un sito antigenico che abbiamo chiamato sito X27.Per determinare come 3 × 1 interagisce con il sito X, abbiamo utilizzato cryo-EM.Molte particelle di trimero preF HPIV3 avevano <3 Fab legati, nonostante il Fab fosse in eccesso molare rispetto al trimero durante la preparazione del campione (Fig. S3a).Abbiamo ottenuto una struttura di 1 Fab in complesso con HPIV3 risolto a 3,62 Å (Fig. S2a e Tabella S1).Abbiamo anche ottenuto una struttura di 3 Fab legati a HPIV3;questa mappa era limitata a una risoluzione di 4,3 Å (figure S2a e S3a).Non abbiamo notato alcuna variazione significativa tra il protomero preF legato e il protomero preF non legato (RMSD = 0,721 su 360 Cα) nella struttura C1.Di conseguenza, abbiamo utilizzato la struttura a risoluzione più elevata per la creazione del modello.3 × 1 lega il dominio III di HPIV3 preF, sporgendo perpendicolarmente e legando solo un protomero, senza contatti aggiuntivi con altre regioni (Fig. 2b).Solo quattro dei sei CDR sono coinvolti nel legame, con CDRH1 e CRDL2 troppo corti per contattare la superficie della glicoproteina (Fig. 2c, d).3 × 1 lega il sito X con una superficie totale sepolta (BSA) di ~ 812 Å2, di cui il VH contribuisce con ~ 612 Å2 e il VL contribuisce con ~ 200 Å2 (Fig. 2b, c).Il confronto con la struttura PI3-A12: HPIV3 ha indicato che 3 × 1 lega lo stesso sito ma è ruotato rispetto a HPIV3 preF (Fig. S3b).Mentre 3 × 1 neutralizza sia HPIV3 che HPIV1, PI3-A12 neutralizza solo HPIV327 e 3 × 1 condivide una piccola somiglianza della sequenza CDR con PI3-A12 (Fig. S3c).A causa della mancanza di una struttura ad alta risoluzione per il complesso PI3-A12:HPIV3, non siamo riusciti a determinare se il 3 × 1 LC si sovrappone al PI3-A12 LC o HC.3 × 1 e PI3-A12 possono quindi legare epitopi distinti all'interno dello stesso sito di HPIV3 preF, poiché mostrano una significativa variazione di sequenza nei residui chiave in 3 × 1 che facilitano il legame (Fig. S3c).una misura BLI della capacità del mAb elencato sul lato sinistro del grafico di impedire il legame del mAb elencato in alto, espressa come calo percentuale del segnale massimo rispetto al segnale massimo in assenza di mAb concorrenti.b Struttura Cryo-EM di 3 × 1 Fab in complesso con HPIV3 preF.A sinistra, viene mostrata una vista dall'alto della mappa 3 × 1:HPIV3 con un Fab (VH mostrato in viola, VL in rosa) e HPIV3 preF in sfumature di grigio.A destra, una rappresentazione della superficie del complesso è mostrata ruotata di 90° con il dominio III in azzurro e il dominio II in giallo su un protomero.I glicani sono mostrati come sfere verdi.c Grafici BSA per ogni residuo Fab che interagisce con il protomero preF, in cima a un allineamento di sequenza alla linea germinale VH e VL per 3 × 1. d Vista dettagliata del sito di legame 3 × 1 con solo i CDR interagenti mostrati nel cartone animato, ruotati di 60 ° dal pannello (b).Le caselle mostrano le posizioni dei pannelli (e) e (f).e Vista ingrandita del sito di legame CDRH3 ruotata di 40° dal pannello (b).f Vista ingrandita del sito di legame CDRL3 ruotata di 110° dal pannello (b).e, f residui CDR che non entrano in contatto con HPIV3 preF sono stati nascosti alla vista per chiarezza.Un'ulteriore analisi della risoluzione locale della nostra mappa ha indicato che il sito di legame aveva una risoluzione più elevata di ~ 3,0 Å rispetto alla risoluzione complessiva di 3,62 Å (Fig. S1a).I 3 × 1 VH e VL insieme legano specificamente la fessura tra l'elica HRA e un motivo foglio-giro-foglio, una breve regione contigua di HPIV3 (Figg. S4a-d e S5a, b).Questa regione è cruciale per il riarrangiamento da preF a postF, con sia l'elica HRA che il motivo foglio-giro-foglio che mostrano> 9 Å di movimento durante il riarrangiamento.L'HRA può anche svolgere un ruolo nella neutralizzazione dell'HPIV1 poiché 3 × 1 probabilmente interagisce con l'HRA su HPIV1 (Fig. S4e).A causa del movimento significativo richiesto a questo sito durante la fusione e della sua potenza come epitopo neutralizzante per RSV preF31, il legame 3 × 1 in questa posizione presenta una solida base strutturale per l'elevata potenza neutralizzante di 3 × 1. Il CDRH2 e il CDRH3 di 3 × 1 formano diverse sporgenze nelle scanalature sulla superficie di HPIV3 preF utilizzando residui non polari (Fig. 2d, e).His52AHC e Phe56HC (CDRH2) insieme a Leu100BHC e Leu100FHC (CDRH3) rappresentano circa il 55% del totale VH BSA (Fig. 2c).La maggior parte degli altri residui di contatto all'interno del VH sono residui polari che formano contatti con generalmente <50 Å2 di BSA.I residui VL di 3 × 1 formano contatti con HPIV3 preF utilizzando gruppi funzionali polari e la spina dorsale del loop CDR, con CDRL1 che comprende una grande sporgenza su HPIV3 preF (Fig. 2c, f).Questa estensione CDRL1 è supportata da Arg91LC, che contatta Tyr31LC e Leu100FHC, con Arg91LC che forma un legame con Asp143 di HPIV3 preF, che è conservato in HPIV1 (figure S5a-c e S6a).Notiamo anche una caratteristica scarsamente risolta nella nostra mappa 3 × 1: HPIV3, che potrebbe essere il C-terminale della proteina F2 dopo la scissione della furina (Fig. S7a, b).Sebbene non vi sia una densità sufficiente per costruire questa regione, la sua vicinanza al sito di legame 3 × 1 potrebbe indicare un ulteriore epitopo di legame.Poiché anche RSV e HMPV contribuiscono in modo significativo alla malattia nei pazienti vulnerabili, abbiamo successivamente cercato di identificare potenziali mAbs neutralizzanti incrociati HMPV/RSV che potrebbero essere combinati con 3 × 1 per creare un potente cocktail con ampiezza ampliata.Sebbene molti mAb mirati a RSV e HMPV siano già in fase di sviluppo, abbiamo utilizzato il nostro approccio sfruttando sonde tetrameriche fluorescenti per identificare cellule B uniche in grado di legare proteine ​​​​F ricombinanti da RSV e HMPV nella conformazione preF, ma non nella postF.RSV preF coniugato con APC, HMPV preF coniugato con R-ficoeritrina (PE), RSV postF coniugato con APC/DyLight755 e HMPV postF coniugato con PE/DyLight650 sono stati miscelati con 200 milioni di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) prima dell'arricchimento magnetico con microsfere anti-PE e anti-APC.Abbiamo quindi ordinato singole cellule B a commutazione di isotipo che si legano alle proteine ​​​​F di RSV e HMPV nella conformazione preF ma non nella conformazione postF, seguita dal sequenziamento di una singola cellula e dalla clonazione dei loro recettori delle cellule B (Fig. 3a).Usando questo metodo, gli alleli della catena pesante (VH3-21) e leggera (Vλ1-40) di una cellula B in grado di legare sia RSV che HMPV sono stati sequenziati e clonati come un mAb che abbiamo chiamato MxR (Fig. 3b).Questa cellula B esprimeva l'isotipo IgG.Come 3 × 1, MxR è stato clonato e prodotto come IgG1 per ulteriori studi.a Cellule B che legano RSV e HMPV dal sangue umano sono state etichettate con tetrameri di streptavidina coniugati con APC della proteina di prefusione di RSV biotinilata (preF) e tetrameri di streptavidina coniugati con PE di HMPV preF biotinilato.b Grafico di citometria a flusso di cellule B preF-binding di RSV e HMPV dopo il gating per CD3−CD14−CD16− CD19+CD20+ (cellule B), IgD−/IgM− (a commutazione di isotipo) e APC/Dylight755- HMPV postF - e PE/Dylight650−RSV postF− (per escludere le cellule che si legano a RSV/HMPV postF, APC, PE o streptavidina).La frazione legata contiene cellule arricchite magneticamente utilizzando microsfere specifiche per APC e PE.I numeri sui grafici sono percentuali delle celle totali nel gate.La casella rossa indica la cella B da cui è stato derivato MxR mAb.c Affinità apparente (KD) di MxR, MPE8 e D25 misurata mediante BLI.d Le cellule Vero sono state infettate con RSV-A, RSV-B o HMPV in presenza di diluizioni seriali di palivizumab (Pali.), D25, MPE8 o MxR.I punti dati rappresentano il titolo di neutralizzazione della riduzione della placca del 60% e provengono da tre esperimenti indipendenti.Gli asterischi indicano ap <0,05 utilizzando un test t a due code con la correzione di Welch.I numeri accanto agli asterischi indicano l'esatto p-value.Pannello (a) creato con BioRender.com.Abbiamo confrontato l'apparente affinità di legame di MxR con l'anticorpo monoclonale specifico per RSV D25, che è stato sviluppato con il nome di nirsevimab per la profilassi di RSV nei neonati32,33.RSV ha due sottotipi antigenicamente distinti, A e B, che condividono il 91% di omologia di sequenza aminoacidica all'interno della proteina F.MxR si lega irreversibilmente con elevata affinità apparente alle proteine ​​​​preF di entrambi i sottotipi RSV A e B (KD <10-12 M ciascuno), anche quando il tempo di dissociazione è stato esteso a 1200 s (Figg. 3c e S8a, d).Anche l'anticorpo monoclonale neutralizzante incrociato MPE834 precedentemente riportato mostrava un'elevata affinità apparente per entrambi i sottotipi di RSV A e B (figure 3c e S8b, e).D25 si legava fortemente anche alla proteina preF del sottotipo B di RSV, ma con un'affinità apparente inferiore di circa 1500 volte (KD = 1, 5 × 10-9 M) rispetto al suo legame con il sottotipo A (Figg. 3c e S8c, f).MxR potrebbe anche legarsi alla proteina preF di HMPV (Figg. 3c e S8g), che era previsto data la deliberata selezione di cellule B che legano sia RSV che HMPV durante l'ordinamento.Rispetto a MPE8, l'apparente affinità di legame di MxR per HMPV era circa 1, 6 volte più forte (figure 3c e S8g, h).Poiché entrambi i sottotipi di RSV circolano a livello globale, era importante valutare la potenza di neutralizzazione (PRNT60) di MxR per i sottotipi A e B. Abbiamo anche confrontato la potenza di neutralizzazione di MxR con l'anticorpo monoclonale specifico per RSV palivizumab, che è attualmente approvato per RSV profilassi nei neonati ad alto rischio.Abbiamo scoperto che MxR ha neutralizzato il sottotipo A di RSV con una potenza almeno 6 volte maggiore rispetto al palivizumab (Figg. 3d e S9a).Contrariamente al palivizumab, che ha una potenza simile contro entrambi i sottotipi35, MxR era anche molto potente contro il sottotipo B, con una potenza 12 volte maggiore (Figg. 3d e S9b).Sebbene D25 avesse una maggiore potenza neutralizzante contro RSV-A (Fig. 3d), secondo quanto riferito D25 ha una potenza più debole contro alcuni ceppi di RSV-B e non neutralizza HMPV36,37,38.MxR e MPE8 avevano una potenza simile nel neutralizzare entrambi i sottotipi di RSV A e B. Tuttavia, MxR aveva una potenza almeno 5 volte maggiore contro l'HMPV, con un PRNT60 di 148 ng/mL rispetto a 838 ng/mL per MPE8 (Figg. 3d e S8c).Sulla base della concentrazione di anticorpi necessari per neutralizzare il 60% del virus vivo, la potenza di MxR contro HMPV ha superato la potenza relativa di palivizumab contro RSV (Fig. 3d).Per comprendere meglio la base della neutralizzazione incrociata osservata con MxR, abbiamo ottenuto una struttura crio-EM di tre Fab MxR legati a RSV preF con una risoluzione di 2, 24 Å (Figg. S2b, S10 e Tabella S1).MxR si lega principalmente al sito antigenico III su RSV con una disposizione equatoriale di Fab attorno a RSV preF.Il sito antigenico III è un epitopo quaternario alla giunzione dei domini I e III di un protomero F e del dominio II del protomero F adiacente in senso orario (indicato come II') (Fig. 4a).MxR si lega con un BSA totale di ~ 1094 Å2, con VH che contribuisce ~ 694 Å2 e VL che contribuisce ~ 400 Å2, di cui ~ 298 Å2 contatti con il protomero F principale e ~ 102 Å2 contatti con il protomero F adiacente.La nostra struttura ha rivelato numerose molecole d'acqua distanziate in tutto il sito di legame che potenzialmente mediano le interazioni tra il protomero Fab e preF (Fig. S11).Questi sono stati omessi dalla Fig. 4 per chiarezza.La modalità di legame è quasi identica all'anticorpo monoclonale neutralizzante incrociato MPE834 e all'anticorpo monoclonale infantile ADI-1942539, che derivano dalla stessa catena germinale pesante (IGHV3-21*01) e leggera (IGLV1-40*01 ) alleli.Il confronto della BSA per residuo di RSV preF in complesso con MxR, MPE8 e ADI-19425 ha rivelato regioni di legame comuni che condividono un'omologia ad alta sequenza con HMPV (Fig. S6b).La sequenza e la struttura di entrambi i CDR1 e CDR2 sono quasi identiche in tutti e tre gli anticorpi, con MxR che ha complessivamente più mutazioni dalla linea germinale rispetto agli altri due (Fig. 4b, c).a A sinistra, viene mostrata una vista dall'alto della mappa DeepEMhanced MxR:RSV cryo-EM, con MxR VH in rosso scuro, MxR VL in rosso chiaro e RSV preF in sfumature di grigio.Viene mostrato solo il dominio Fv del Fab.A destra, una rappresentazione superficiale della struttura viene mostrata ruotata di 90°.Un protomero preF è colorato per i suoi domini strutturali e un MxR Fv è mostrato in un contorno a fumetti.Il dominio DII del protomero adiacente in senso orario è in rosa chiaro e designato DII' per differenziarlo dal DII dell'altro protomero, colorato in viola.I glicani sono mostrati come sfere verdi.( b ) Grafici BSA per i residui MxR, MPE8 e ADI-19425 che interagiscono con RSV preF, in cima a un allineamento di sequenza dei geni V della linea germinale.La lettera H indica i legami a idrogeno.La lettera S indica i ponti salini.I residui nelle caselle colorate corrispondono ai residui mostrati nei pannelli (d ed e).c Vista dettagliata del sito di rilegatura su RSV preF con i CDR di MxR, MPE8 e ADI-19425 sovrapposti e mostrati nel fumetto.MPE8, in verde, e ADI-19425, in blu, sono mostrati in trasparenza.Il sito antigenico III è delineato dal contorno bianco.d Vista ingrandita del sito di rilegatura CDRH3 ruotata di 30° in senso antiorario dal pannello (c).e Vista ingrandita del sito di rilegatura CDRL3, ruotata di 65° in senso orario dal pannello (c).I primi quattro residui sono mostrati come catena principale solo per aumentare la chiarezza e illustrare la somiglianza di CDRL3 tra gli anticorpi.Le regioni CDRH3 di MxR, MPE8 e ADI-19425 hanno un maggior grado di sequenza e variazione strutturale, con quasi nessun residuo conservato, nonostante tutti i legami vicino all'interfaccia DI/DII'/DIII all'interno del sito antigenico III.C'è una piccola fessura in questa interfaccia, in cui i loop CDRH3 si estendono a vari livelli (Fig. 4c, d).MPE8 CDRH3 è il più lungo, mentre MxR è il più corto e ADI-19425 è di lunghezza intermedia.In particolare, ADI-19425 utilizza un legame disolfuro per stabilizzare questo anello, mentre MPE8 e MxR mancano di questo legame (Fig. 4d) 34,39.La geometria rigida imposta dal legame disolfuro può compromettere la capacità di ADI-19425 di legare HMPV.La necessità dell'MPE8 CDRH3 nel formare la corretta geometria dell'ansa per legarsi all'interno della fessura del sito antigenico III può quindi essere una base strutturale alla base della ridotta neutralizzazione dell'HMPV da parte dell'MPE8 rispetto a MxR (Figg. 4c, d e 3d).A causa di un CDRH3 relativamente più corto di MPE8, MxR si lega in questa fessura senza contattare DII', e quindi non richiede un anello esteso per facilitare il legame (Figg. 4d e S6b).Solo il CDRL2 di MxR contatta DII' (Fig. 4c).Quando i CDR sono sovrapposti al protomero HMPV, scopriamo che il sito di legame generale è molto simile, comprendendo contributi del sito antigenico simili e identità dei residui (Fig. S12a, b).Tuttavia, la fessura di legame disponibile è più stretta e più corta, il che può ostacolare stericamente i loop ADI-19425 e MPE8 CDRH3 (Fig. S12c).I CDRL3 mostrano anche alcune variazioni nei residui interagenti (Fig. 4e).Sia MPE8 che MxR condividono un residuo basico nella posizione 93LC che non è condiviso con ADI-19425, e tutti e tre gli anticorpi presentano disposizioni di loop leggermente diverse nei residui 94-96LC (Fig. 4e).Tuttavia, le modalità di associazione dei CDRL3 sembrano simili, senza le caratteristiche uniche viste nei CDRH3.Successivamente abbiamo studiato se i dati di legame e neutralizzazione in vitro si sarebbero tradotti in protezione in vivo in un modello di sfida animale.Anche se i virus della parainfluenza umana non si replicano nei topi, la replicazione del tratto respiratorio superiore e inferiore può essere dimostrata sia nei criceti che nei ratti cotton30,40.Per RSV, titoli virali comparabili sono stati riportati nei polmoni di criceti e ratti cotone41.Sebbene alcuni studi abbiano osservato titoli più elevati di HMPV nei polmoni dei ratti cotone rispetto ai criceti42,43, ciò potrebbe essere correlato alle differenze nel ceppo virale utilizzato, alla dimensione dell'inoculo e alla tempistica del campionamento polmonare.Il modello del criceto è stato ampiamente utilizzato per valutare i candidati al vaccino per virus parainfluenzali, RSV e HMPV44,45,46,47,48,49,50,51,52.Poiché tutti i virus in questo studio potrebbero replicarsi nei criceti44,45,51,53,54,55,56,57, abbiamo eseguito test preclinici di MxR e 3 × 1 nel modello di criceto siriano dorato.Abbiamo eseguito iniezioni intramuscolari nei criceti il ​​giorno -2, criceti infetti per via intranasale il giorno 0 e raccolto polmoni e turbinati nasali il giorno 5 dopo l'infezione per valutare l'efficacia degli anticorpi monoclonali come profilassi contro l'infezione (Fig. 5a).Questo dosaggio, via e tempi di somministrazione sono simili a quelli utilizzati nei modelli di infezione da RSV del ratto cotone41,58,59.Abbiamo eseguito esperimenti di determinazione della dose con 3 × 1 contro HPIV3 e MxR contro RSV, utilizzando palivizumab come benchmark.Due giorni dopo l'iniezione intramuscolare della dose di 5 mg/kg nei criceti, abbiamo osservato concentrazioni sieriche di mAb di 5,1-9,7 µg/ml (Fig. 5b).Alla dose di 5 mg / kg, MxR e 3 × 1 hanno completamente soppresso la replicazione virale di HPIV3 e RSV, rispettivamente, nei polmoni (Fig. 5c, d).Al contrario, palivizumab a 5 mg / kg non ha soppresso completamente la replicazione virale nei polmoni, anche se palivizumab e MxR avevano un EC90 simile contro RSV (Fig. 5d, e).Ciò è coerente con i dati del modello di ratto cotone in cui è stata osservata anche un'infezione da rottura con palivizumab a 5 mg/kg60.La somministrazione profilattica di 3 × 1 a 5 mg/kg ha avuto scarso impatto sulla replicazione nei turbinati nasali (Fig. 5c).Tuttavia, la somministrazione profilattica di MxR a 5 mg/kg ha ridotto la replicazione di RSV nei turbinati nasali di oltre 47 volte (Fig. 5d).Ciò è in contrasto con palivizumab, che non ha avuto alcun effetto sulla replicazione di RSV nei turbinati nasali.Poiché la dose di 5 mg/kg sopprimeva la replicazione virale di RSV e HPIV3, abbiamo anche testato questa dose per HPIV1 e HMPV.La replicazione dell'HPIV1 è stata completamente bloccata nei polmoni di tutti gli animali tranne uno ed è stata significativamente ridotta nei turbinati nasali dei criceti che hanno ricevuto la profilassi 3 × 1 (Fig. 5f).La replicazione dell'HMPV è stata significativamente ridotta di oltre 206 volte nei polmoni dei criceti che hanno ricevuto la profilassi MxR (Fig. 5g).uno schema di esperimenti in cui i criceti sono stati iniettati per via intramuscolare con 3 × 1 o MxR due giorni prima della sfida intranasale con 105 pfu di virus.b Le concentrazioni sieriche di 3 × 1 e MxR due giorni dopo la somministrazione di mAb a 5, 2,5 e 1,25 mg/kg sono state misurate mediante ELISA (n = 4 animali/dose).Dose-risposta di 3 × 1 (c) e MxR (d) sulla replicazione di HPIV3 e RSV, rispettivamente (n = 5 animali sperimentali/dose/virus, n = 5 turbinati nasali/virus di animali di controllo e n = 4 polmoni di animali di controllo /virus).e Concentrazione efficace al 90% (EC90) di palivizumab contro RSV, MxR contro RSV e 3 × 1 contro HPIV3 sulla base di esperimenti dose-risposta.f HPIV1 e (g) replicazione dell'HMPV dopo l'iniezione con 3 × 1 o MxR a 5 mg/kg, rispettivamente (n = 8 animali/gruppo in due esperimenti indipendenti per HPIV1; e n = 10 turbinati nasali animali/gruppo, n = 10 polmoni di animali sperimentali e n = 7 polmoni di animali di controllo in due esperimenti indipendenti per HMPV).I titoli virali sono stati misurati mediante analisi della placca negli omogenati polmonari e nasali di singoli criceti a 5 giorni dall'infezione.Le linee tratteggiate indicano il limite di rilevamento.Le barre rappresentano la media e gli asterischi indicano p <0,05 a due code secondo il test di Mann-Whitney rispetto ai criceti di controllo iniettati con 1 × DPBS.I numeri accanto agli asterischi indicano l'esatto p-value.Pannello (a) creato con BioRender.com.Se somministrati insieme come cocktail, MxR e 3 × 1 potrebbero fornire un'ampia protezione contro HMPV, RSV, HPIV3 e HPIV1.Questo è clinicamente rilevante perché tutti e quattro i virus insieme rappresentano la maggior parte delle gravi infezioni virali respiratorie nei riceventi di trapianto di cellule staminali ematopoietiche.Rispetto alla co-somministrazione di quattro mAb (uno per virus), l'utilizzo di due mAb per mirare a quattro virus consente la somministrazione di una dose più elevata di ciascun mAb, che potrebbe massimizzare l'efficacia riducendo al minimo la tossicità.La somministrazione di un cocktail potrebbe anche essere utile nel contesto di co-infezioni con più virus respiratori poiché le co-infezioni possono essere associate a esiti peggiori nei pazienti immunocompromessi16.Fr.Chim.